中檢維康iELisa黃曲霉毒素ELISA試劑盒

1. 概要(yao)

2. 黃(huang)曲霉(mei)毒素是一類真菌（如黃(huang)曲霉(mei)和寄生曲霉(mei)）的(de)有(you)毒的(de)代謝產物，它們具有(you)很(hen)強的(de)致癌性. 黃(huang)曲霉毒(du)素M<蘇b>1是黃曲霉毒(du)素B<蘇(su)b>1的代謝產物。經攝入含有黃(huang)曲霉毒素B<蘇b>1飼(si)料(liao)的奶牛(niu)產出的牛(niu)奶中，其中便含有(you)黃曲霉毒(du)素M<蘇(su)b>1。由(you)于黃曲霉毒(du)素(su)M<蘇b>1相(xiang)當穩定，巴氏滅菌法(fa)也無法(fa)將其殺滅，所以檢測黃(huang)曲霉毒素M<蘇(su)b>1不僅要在飼(si)料(liao)原料(liao)中(zhong)檢測，而且在終(zhong)產品中(zhong)的(de)含量也需要進行測定。用iELisa 黃曲霉(mei)毒素M<蘇b>1快速檢測試劑(ji)盒(he)可以(yi)準確地(di)檢測牛奶、酸奶、奶酪和奶粉中的黃曲霉毒素 M<蘇b>1。

3. 原理

4. 本產品是利(li)用抗體-抗原免(mian)疫(yi)反(fan)應檢測原理建(jian)立的一(yi)種定量檢測試劑盒。加入黃曲霉毒素M<蘇(su)b>1（AFLA M<蘇(su)b>1）標準品(pin)或樣品(pin)后，黃曲(qu)霉毒素M<蘇b>1與微(wei)孔中的抗體相結合。洗去沒有結合的黃曲霉(mei)毒素M<蘇b>1，加(jia)入酶標抗(kang)原，與黃曲(qu)霉(mei)毒素M<蘇(su)b>1與抗體沒(mei)有(you)結(jie)合(he)的部位(wei)相結(jie)合(he)。洗去(qu)沒(mei)有(you)結(jie)合(he)的酶標抗原，加(jia)入TMB底物顯藍色，加(jia)入終止(zhi)液后顏色由藍變黃，用酶標儀在(zai)450nm處檢測，吸光值與樣品中黃曲霉毒素M<蘇b>1含量(liang)成負相關，與標準曲線比較即可得出黃曲霉毒素(su)M<蘇(su)b>1的含量(liang)。

   3. 試劑(ji)盒的組成

5. 包被有抗體(ti)的(de)96微孔板：1塊（96 孔，12 條×8 孔）
6. AFM1標準品：0 ng/mL 、0.05 ng/mL、0.1 ng/mL、0.2 ng/mL、0.5 ng/mL：

7. 1 瓶 × 1.0mL       &nbsp;           

8. AF-M1酶(mei)標(biao)抗原：            1 瓶 × 15mL
9. 10× 濃縮洗滌液：            1 瓶 × 50mL
10. AF-M1稀釋緩沖液:           1 瓶 × 50mL
11. 顯色底(di)物液(ye)：                1 瓶(ping) ×12mL
12. 反(fan)應終止液：                1 瓶 × 13mL
13. 試劑盒說(shuo)明(ming)書
14. 質控報(bao)告
15. 需要的儀器、試劑

16. 1）儀器

17. 酶標儀(yi)450nm（iELisa全自動酶標儀或相當者）
18. 微(wei)量移液器：20μL-200μL單道，100μL-1000μL單道, 50μL-300μL八道
19. 高速(su)離心機(ji)
20. 酶(mei)標板振蕩器(qi)
21. 渦旋混合器(qi)
22. 振蕩器
23. 蒸發(fa)設備、恒溫(wen)箱
24. 100mL量(liang)筒
25. 計(ji)時器
26. 天平：感量0.01g
27. 離心管1.5mL、50mL

28. 2）試劑

29. 甲醇、正庚烷、二氯甲烷
30. 樣(yang)品處理

31. 5.1 牛奶(nai)：

32. 取牛(niu)奶1.0 mL樣品，用離心機（4000RPM）離心10min.。
33. 離心后用移液器*去除上層奶油(you)。
34. 取200μL下層脫脂牛(niu)奶，加入200μLAF-M<蘇b>1稀釋緩沖液（1:1）稀釋。

35. 稀釋倍數：2

    5.2 酸(suan)奶：

36. 取(qu)酸奶樣品2.0g，用離心機（4000RPM）離(li)心10分鐘。（如沒有冷凍離心(xin)機，可將樣品先冷卻到10℃，再(zai)離心）
37. 離心(xin)后，取200μL上層澄清液(ye)于1.5mL離心管中，加入200μL AF-M<蘇(su)b>1稀釋緩沖(chong)液（1:1）稀釋，渦旋混(hun)(hun)合器混(hun)(hun)勻。

38. 稀釋(shi)倍數：2

    5.3 奶粉(fen)：

39. 用天(tian)平稱(cheng)取2.0g奶(nai)粉到錐形瓶中(zhong)，再加入10mL 50℃左右(you)的純(chun)水（復原乳）。
40. 用力振蕩(dang)3分鐘.，使充分(fen)溶(rong)解(jie)。
41. 按照5.1牛奶樣(yang)品處(chu)理步驟進(jin)行。

42. 稀釋倍(bei)數：10 （檢測范圍(wei)：0.5---5 ppb）

    5.4 奶粉(fen)（高靈(ling)敏度(du)）：

43. 用天平稱取2.0g奶粉到錐形瓶中(zhong)，再加入(ru)5mL 50℃左右的純水（復原(yuan)乳）。
44. 用力(li)振(zhen)蕩3分鐘(zhong).，使充分溶解(jie)。
45. 按照5.1牛奶樣品(pin)處理(li)步驟進行。

46. 稀釋倍(bei)數(shu)為5（檢測范圍：0.25---2.5 ppb）

    5.5 奶(nai)酪：

47. 用天平稱取2.0g粉(fen)碎(sui)的奶酪放(fang)入(ru)離心瓶中(zhong)，加入(ru)40.0mL二氯甲(jia)烷(wan)，充分溶解(jie)混勻后，劇(ju)烈振(zhen)蕩15分鐘.。
48. 過濾，取10.0mL，60℃氮(dan)氣吹干。
49. 分別加入0.5mL甲醇、0.5mL PBS、1.0mL庚烷，復容。
50. 3000轉/分鐘離心(xin)15分鐘.。
51. *去除上層庚(geng)烷。
52. 取100μL下層(ceng)提取液于1.5mL離心管中，加入(ru)400μL AF-M<蘇b>1稀釋緩沖液(ye)（1:4）稀釋，渦(wo)旋混(hun)合器混(hun)勻，取100μL用于檢(jian)測。

53. 稀釋倍數：10

    6． 酶聯免疫分析程序

    6.1測定之前注(zhu)意事項

54. 使用前將所有試劑平衡至室溫(wen)（20-25℃）。
55. 使用(yong)后(hou)迅速將試(shi)劑(ji)放入2-8℃冷藏。
56. 在(zai)ELISA分(fen)析中的再(zai)現性，很大程度(du)上取決于洗板的一(yi)致性，正(zheng)確(que)的洗板操作是(shi)ELISA測定(ding)程序(xu)中的要點。
57. 所有溫育(yu)過程應(ying)避(bi)免陽光直射，并按(an)要求用蓋板(ban)覆蓋住酶(mei)標板(ban)。

58. 6.2溶(rong)液的(de)配制

    洗(xi)(xi)滌液的配制：將濃縮洗(xi)(xi)滌液用純(chun)水稀釋10倍后使(shi)用(yong)。（例如：取(qu)10 mL 濃縮液+90 mL純(chun)水(shui), 可(ke)以用于32孔的(de)檢測）。

    6.3測(ce)定程序

59. 將(jiang)足夠(gou)標準(zhun)品(pin)和樣品(pin)所(suo)用(yong)數量的孔條插入酶標板架，標準(zhun)品(pin)和樣品(pin)做兩個平行實(shi)驗，記錄下標準(zhun)和樣品(pin)的位置(zhi)。未使(shi)用(yong)的酶標板用(yong)鋁箔袋(dai)封好置(zhi)2-8℃冷藏保(bao)存。
60. 分別(bie)吸取(qu)100μL標準品(pin)(pin)和樣品(pin)(pin)加至(zhi)相應的微孔（雙孔）中,，加蓋，室溫撫育50分鐘.。
61. 倒出孔中的液體，每孔加入250μL稀釋好的(de)洗(xi)滌液，置(zhi)于(yu)酶標(biao)板振(zhen)蕩器上振(zhen)蕩30秒（或(huo)者手工(gong)振蕩(dang)），重(zhong)復(fu)操(cao)作四次(ci)。洗完后用力在吸水紙上拍干。
62. 每(mei)孔(kong)加入AF-M<蘇b>1酶(mei)標抗原100μL，加蓋，室溫撫育(yu)30分鐘(zhong).。
63. 倒出孔中的液(ye)體(ti)(ti)，每孔加入250μL 稀釋好的洗滌液(ye)，置于酶標板振蕩器(qi)上(shang)振蕩30秒（或者手工振蕩），重(zhong)復操(cao)作(zuo)四次。洗(xi)完后(hou)用力在吸水紙上拍干。
64. 每(mei)孔(kong)加入100μL顯色(se)底物液(ye)，加蓋(gai)，室溫撫育10分鐘.。
65. 每孔加入50μL反應終止液。
66. 置于酶標儀中，振蕩混勻，在450nm處測定吸光(guang)度值（OD值），參考波長630nm。（iELisa全自動(dong)酶標儀可以直接(jie)讀出、打印(yin)濃度值(zhi)）

67. 7.  結果判(pan)定

68. 所(suo)獲得的每個濃度標(biao)準(zhun)溶液和樣本(ben)吸(xi)光度值(zhi)的平均值(zhi)（B）除以di一個標準（0標準）的吸(xi)光度值（B<蘇b>0）再乘以100%，即百分吸(xi)光度(du)值。

69. 百分吸(xi)光度(du)值（%）＝	B	×100%
    	B<蘇(su)b>0

    以黃曲霉M1標準品濃度值（ppb）為(wei)X軸，百分吸光(guang)度值為Y軸，繪制(zhi)標準曲(qu)線圖。相對應(ying)每一(yi)個樣(yang)品的(de)濃度(du)可(ke)以從標準曲(qu)線上讀出(chu)。也可(ke)以用(yong)(yong)回歸(gui)方程法，計算(suan)出(chu)樣(yang)本(ben)溶液(ye)濃度(du)。利用(yong)(yong)計算(suan)機(ji)專(zhuan)業軟件，更便于(yu)大量樣(yang)品的(de)快速分析。

70. 樣品的實際(ji)濃(nong)度為讀數結果乘以(yi)相應稀釋倍數。
71. 如果測定(ding)值(zhi)超出檢測范圍，樣(yang)品(pin)提取溶(rong)液按(an)一定(ding)的比例用陰性牛奶樣(yang)品(pin)進行稀(xi)釋。

72. 8.  注意事項

73. 室溫低(di)于20℃或試劑及標本未回到室溫（20- 25℃）會導(dao)致數值偏低(di)。
74. 在(zai)洗板(ban)(ban)過(guo)程中如(ru)果(guo)出現板(ban)(ban)孔干(gan)燥過(guo)久的情況，則會(hui)出現標準曲(qu)線不(bu)成(cheng)線性，重復性不(bu)好(hao)的現象(xiang)。所以洗板(ban)(ban)排干(gan)后(hou)應立即(ji)進行下一步(bu)操作。
75. 標準物質和顯色(se)液(ye)對(dui)光(guang)敏感，避免(mian)直接暴露在(zai)光(guang)線下。
76. 混合(he)要(yao)均勻(yun)，洗(xi)板要(yao)*（包(bao)括加樣(yang)品和標準(zhun)液的(de)時候都必需充分混合(he)均勻(yun)）。
77. 反應停止液為強酸(suan)性物質，避(bi)免接(jie)觸皮膚。
78. 不要使用(yong)過了有效(xiao)期的試劑(ji)盒(he)，也不要混合使用(yong)不同批次的試劑(ji)盒(he)，這樣(yang)會引起測定結果不準確。
79. 試劑盒的儲存條件是2-8℃，切勿冷凍。

80. 9.  檢測(ce)方法靈敏度(du)、準確度(du)、精(jing)密度(du)

    1）試劑盒(he)靈敏度: 0.05ppb

    2）檢測范圍：牛(niu)奶0.1---1.0 ppb

                 ;酸奶0.1---1.0 ppb

           &nbsp;   奶(nai)粉0.5---5.0ppb；0.25---2.5 ppb

      奶酪0.5---5.0ppb

    3）試劑盒變異系數：小(xiao)于(yu)20%。

    4）試劑盒準確度：回收(shou)率(lv)范圍(wei)在70%-120%之間(jian)。