中檢維康iELisaT-2毒素檢測試劑盒

1. 概要

T2毒素（T2）是由多(duo)種鐮刀菌(jun)產生的一種霉菌(jun)毒素。主要污染小麥、大(da)麥、玉米等糧食(shi)作物及其制品，對人類健康及畜牧(mu)業構成了較大(da)危害。T-2毒素(su)主(zhu)要影響血液，肝臟(zang)，腎臟(zang)，胰腺肌肉及淋巴細(xi)胞的功能，T-2毒素中毒后的一般臨床癥(zheng)狀為厭食、嘔(ou)吐(tu)、腹瀉(xie)、生長(chang)停(ting)滯、繁(fan)殖和神經機(ji)能障礙等(deng)。使(shi)用T2毒(du)素試(shi)劑盒則能夠(gou)快速而準(zhun)確的分析樣品中T2毒素殘留。

1. 原理

測定的基礎是抗原(yuan)-抗體反(fan)應。微孔板上包被有偶聯抗原。分別加入T2毒素標(biao)準品(pin)或樣(yang)品(pin)、酶標(biao)記物和(he)抗體于微孔中，樣(yang)品(pin)/標準(zhun)品競爭(zheng)結合抗(kang)(kang)體，酶標記物可與(yu)一(yi)抗(kang)(kang)結合，再(zai)于酶標版上的包被抗(kang)(kang)原結合。反(fan)應洗(xi)滌(di)后，加入TMB底物顯藍色，加(jia)入(ru)終止液后顏色由(you)藍變黃，用酶標儀(yi)在(zai)450nm處檢測，吸光(guang)值與(yu)樣品中T2毒素含量成負相關，與(yu)標準曲線比(bi)較即可得出T2毒素的(de)含量(liang)。

1. 試劑(ji)盒的組(zu)成

1. 包被有抗(kang)原的96微孔(kong)板：1塊（96 孔，12條(tiao)×8 孔）
2. T2毒素(su)標準品：0ng/mL、0.5ng/mL、 1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、20ng/mL                        1 瓶(ping) × 1.0mL
3. T2抗體(ti)                      1瓶 ×10mL
4. 酶標記物(wu)                    1 瓶 ×10mL
5. 10× 濃縮洗滌液：            1瓶 × 50mL
6. T2稀釋緩沖液A：             1瓶 × 50mL
7. T2稀釋(shi)緩沖液B：             1瓶 × 50mL
8. 顯色底物(wu)TMB：              1瓶 × 17mL
9. 終止液：                     1瓶 × 7mL
10. 試劑盒說明書：               1份
11. 質檢(jian)報告：                   1份

1. 需要的儀器(qi)、試劑

1）儀器   

1. 酶(mei)標儀(yi)450nm（iELisa全自動酶標儀(yi)或相當者）
2. 微量移液(ye)器：20μL-200μL單道，100μL-1000μL單(dan)道, 50μL-300μL八道
3. 多(duo)功(gong)能旋轉混合器（或者搖(yao)床、高速均質(zhi)器）
4. 酶(mei)標(biao)板振蕩器
5. 渦(wo)旋混合器
6. 50mL離心管(guan)
7. 1.5mL離心管
8. 定(ding)性濾紙
9. 過濾漏斗
10. —天平：感量0.01g

1. 試劑

1. 樣品提取(qu)液70%甲醇：取700mL甲醇，加300mL純(chun)水，混勻。

1. 樣品(pin)處理

5.1谷物（玉(yu)米、小麥、高粱(liang)、大(da)米、大(da)豆）：

1. 稱(cheng)取5.0g粉碎樣品于50mL離心管中，加(jia)入25.0mL樣品提取液70%甲醇,置于多功能旋轉混(hun)合器上振蕩30分鐘（或使用高速均(jun)質(zhi)器均(jun)質(zhi)3分鐘，或搖床上振蕩(dang)40分鐘）。
2. 將提取(qu)液用普通濾紙過濾，吸(xi)取100μL濾液置于1.5mL離心管中(zhong)，加入900μL T2稀釋緩沖(chong)液A，用渦旋混合器混勻。

稀釋倍數：50

5.2飼(si)料：

1. 稱(cheng)取5.0g粉碎樣品于50mL離(li)心管(guan)中(zhong)，加入25.0mL樣品提取液(ye)70%甲醇(chun),置于多功能旋轉混(hun)合器上振(zhen)蕩30分(fen)鐘（或使用高速(su)均質器均質3分鐘，或搖床上振蕩(dang)40分鐘）。
2. 將(jiang)提取液用(yong)普通濾紙過(guo)濾，用(yong)0.22μm有機系濾(lv)膜(mo)過濾(lv)后(hou)，取100μL濾液置于(yu)1.5mL離心管中，加入900uL T2稀釋緩沖(chong)液(ye)B，用渦(wo)旋混(hun)合器混(hun)勻。

稀釋倍數：50

6． 酶聯免疫(yi)分析程(cheng)序

6.1測定之前注(zhu)意事項

1. 使用(yong)前(qian)將所(suo)有試劑平衡至室溫（20-25℃）。
2. 使用后迅速將(jiang)試劑(ji)放入2-8℃冷藏。
3. 在ELISA分(fen)析中的(de)(de)再(zai)現性(xing)(xing)，很大程度上取決于洗(xi)板(ban)(ban)的(de)(de)一致性(xing)(xing)，正(zheng)確(que)的(de)(de)洗(xi)板(ban)(ban)操作(zuo)是(shi)ELISA測(ce)定程序中(zhong)的要點。
4. 所有溫育(yu)過程應避免陽光直射(she)，并按要求用(yong)蓋板覆蓋住酶標板。

6.2溶液的配制(zhi)

1. 提取(qu)液(ye)的(de)配(pei)制: 根據實驗所需的量(liang)配(pei)制70%的甲醇(chun)水(shui)溶液（水(shui)要用(yong)純水(shui)、或蒸餾水(shui)、去離子水(shui)）
2. 洗滌液的配制：將(jiang)濃(nong)縮洗滌液用純(chun)水(shui)稀釋10倍后使用。（例(li)如：取10 mL 濃縮(suo)液+90 mL純水(shui), 可以用于32孔的檢測）。

6.3測(ce)定程序

1. 將足夠標準品(pin)(pin)和樣(yang)品(pin)(pin)所用數(shu)量的(de)孔條(tiao)插入酶(mei)標板(ban)架，標準品(pin)(pin)和樣(yang)品(pin)(pin)做兩個平行(xing)實(shi)驗，記錄下(xia)標準和樣(yang)品(pin)(pin)的(de)位(wei)置(zhi)。未使用的(de)酶(mei)標板(ban)用鋁箔袋(dai)封(feng)好置(zhi)2-8℃冷藏保存(cun)。
2. 分別吸取50μL標準品和(he)樣品加至相應的微孔(kong)（雙孔(kong)）中(zhong)，然后(hou)再各加入50μL的(de)酶標記物，后加入50μL的T2抗體(ti)，裝(zhuang)入袋中密封，室(shi)溫（25℃）溫育20分(fen)鐘。
3. 倒出孔(kong)中的液體(ti)，每孔(kong)加入(ru)250μL稀釋好的洗(xi)滌(di)液洗(xi)滌(di)，重復(fu)操(cao)作四次。洗(xi)板時每次間隔30s，洗完后用力(li)在吸(xi)水紙上排干。
4. 每(mei)孔加入100μL顯色(se)底(di)物，避光(guang)室溫(wen)（25℃）溫育10分(fen)鐘。
5. 每孔(kong)加入50μL終止液，混(hun)勻。
6. 置于酶標儀中，振(zhen)蕩混勻(yun)，在450nm處(chu)測定吸光(guang)度值（OD值），參比(bi)波長630nm。（iELisa全自動酶標儀可以直接讀出、打印濃度值）。

7.  結果判定(ding)

1）所獲得(de)的(de)每個濃度(du)標準(zhun)溶(rong)液和樣本吸光度(du)值(zhi)的(de)平均值(zhi)（B）除以(yi)DI個(ge)標準(zhun)（0標(biao)準）的吸光度值(zhi)（B<蘇b>0）再乘以100%，即百分吸(xi)光度(du)值(zhi)。

以(yi)T2毒素標準(zhun)品濃度值(zhi)（ppb）為X軸，百(bai)分吸(xi)光度(du)值為Y軸，繪(hui)制標準(zhun)曲線圖。相(xiang)對(dui)應(ying)每一個樣品(pin)的濃度(du)可以從標準(zhun)曲線上(shang)讀(du)出。也可以用回(hui)歸方程法，計算出樣本溶液濃度(du)。利用計算機(ji)專業軟(ruan)件，更(geng)便于大量樣品(pin)的快速分析。

1. 樣(yang)品的實(shi)際濃度為讀數結果乘以(yi)相應稀釋倍(bei)數。
2. 如(ru)果(guo)測(ce)(ce)定值(zhi)超出檢(jian)測(ce)(ce)范圍，樣品(pin)提取(qu)溶(rong)液按一(yi)定的比例用70%甲醇進行稀釋。

8.  注(zhu)意(yi)事項

1. 室溫低于20℃或試劑及樣(yang)品(pin)未回到室溫（20- 25℃）會導致數值(zhi)偏(pian)低。
2. 在洗板過程(cheng)中(zhong)如果出(chu)現板孔干燥過久的情況，則(ze)會出(chu)現標準曲線不(bu)成線性(xing)，重(zhong)復(fu)性(xing)不(bu)好的現象。所(suo)以洗板排干后應立即(ji)進行下一步操作(zuo)。
3. 標準物(wu)質和顯色液對光敏感，避免直接(jie)暴露在光線下。
4. 混合(he)要均勻，洗板要*（包括加樣品和標準液的(de)時候都必需充分(fen)混合均勻）。
5. 終止液(ye)為強酸性物質，避免接(jie)觸皮膚(fu)。
6. 不(bu)要(yao)使用(yong)過了有效期(qi)的試(shi)劑盒，也不(bu)要(yao)混合使用(yong)不(bu)同批(pi)次的試(shi)劑盒，這樣(yang)會引起測(ce)定結果不(bu)準確(que)。
7. 試(shi)劑盒的(de)儲存條(tiao)件是2-8℃，切勿冷凍(dong)。

9.  中檢維康iELisaT-2毒素檢測試劑盒的性能指(zhi)標

1. 檢(jian)測限LOD: 谷(gu)物10ppb(μg/kg)，飼料15ppb，（LOD：空白樣品測定值+2倍標準偏差(cha)SD）
2. 定量限LOQ: 谷物25ppb，飼料(liao)30ppb。
3. 定量檢(jian)測范圍：谷物25-1000ppb，飼料30-1000ppb。